Teste, teste, teste: os três testes do coronavírus
Dr. Ignacio López-Goñi.
Como funcionam os testes de diagnóstico de coronavírus e para que servem: sensibilidade, especificidade, falsos positivos, falsos negativos.
A OMS disse isso há algumas semanas: Teste, teste, teste!
Durante uma infecção, o vírus se multiplica ativamente. Quando começa, o vírus pode ser detectado em amostras biológicas (esfregaço da faringe ou nasofaringe, aspirado traqueal ou lavado broncoalveolar). Primeiro, há um período de latência em que ainda não é possível detectar a resposta do seu sistema imunológico. Mas depois de alguns dias, você começa a produzir anticorpos. Os anticorpos do tipo IgM são produzidos primeiro até atingir o máximo em 7 a 10 dias e depois quase desaparecem. Essa resposta primária é indicativa de uma infecção aguda. Posteriormente, ocorrerá a resposta imune secundária, mais rápida, mais intensa e prolongada. Anticorpos do tipo IgG serão produzidos e durarão mais tempo no sangue. Além disso, ao nível das secreções mucosas, como as secreções respiratórias, a IgA desempenha um papel predominante.
Para detectar a presença do vírus (detecção direta), podemos usar dois tipos de testes: PCR, que detecta o genoma do vírus, ou testes imunológicos, que detectam proteínas do vírus (Ag – antígenos). O terceiro tipo de teste é o que detecta os anticorpos que você produz em resposta à infecção; são os testes sorológicos para detecção indireta do vírus. Embora existam várias modalidades de cada um desses tipos de testes, explicaremos brevemente como eles funcionam.
Detectar o genoma do vírus: RT-PCR
O genoma do coronavírus SARS-Cov-2 é uma molécula de RNA de fita simples de cerca de 30 kilobases. Depois que a amostra é coletada (o esfregaço nasofaríngeo ou aspirado mais profundamente), a primeira coisa a fazer é extrair o genoma do vírus. Isso normalmente é feito usando um kit de extração de ácido nucleico. Assim, além de inativar o vírus, obtemos seu genoma de RNA. Em seguida, você deve copiar esse RNA na forma de DNA. Isso é feito com outro kit que usa uma enzima chamada transcriptase reversa ou Retro Transcriptase (daí o “RT”, do nome RT-PCR). Então, o genoma do vírus na forma de DNA é amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR, em inglês. Observe que aqui PCR não significa “Proteína C Reativa”). Essa amplificação consiste em fazer milhões de cópias de um fragmento do DNA, para que possamos “visualizá-lo” ou detectá-lo usando um sistema específico. O sistema de PCR em tempo real ainda permite quantificar a amostra, ou seja, saber quantas cópias do vírus temos por mL.
Se a reação for positiva, isso mostra que havia RNA do vírus, ou seja, que a pessoa estava infectada.
Como a primeira coisa que obtivemos do vírus foi seu genoma, esse tipo de teste é o primeiro a ser desenvolvido. De fato, desde 13 de janeiro, a OMS já publicou o primeiro protocolo. Normalmente, geralmente são realizados dois testes: um para triagem e um segundo confirmatório. Você pode até fazer uma confirmação adicional de terceiros. Estes três ensaios de RT-PCR são projetados para detectar três genes diferentes do vírus.
Estes testes de PCR são muito específicos e sensíveis. Eles geralmente levam algumas horas para serem concluídos. Eles exigem equipamentos especializados e pessoal técnico. Eles podem ser positivos nas pessoas antes mesmo de mostrarem sintomas, mas já têm o vírus. Durante toda a doença, eles podem acompanhar como está indo a infecção, porque quando a pessoa já está curada e não possui o vírus ativo, em princípio deve ser negativa. Não se pode excluir que pacientes convalescentes “sem sintomas” possam ser positivos na RT-PCR e continuar sendo portadores do vírus.
Detectar proteínas de vírus: Testes de Antígenos – Ag
Outra maneira de confirmar a presença do vírus é detectar suas proteínas ou antígenos. Existem diferentes técnicas ou suportes para realizar esse tipo de teste, mas no final mais ou menos todos têm a mesma base. Anticorpos específicos são fixados em um suporte que reagirá contra algumas proteínas do vírus. Nesse caso, é contra as proteínas na superfície do envelope (proteína S), aquelas que se projetam para fora e formam aquelas espículas que dão nome a esse tipo de vírus, o coronavírus. Se houver partículas virais na amostra (a mesma que para RT-PCR), elas serão fixadas ao anticorpo. É como se o vírus tivesse sido capturado pelo anticorpo. Em seguida, um segundo anticorpo ao vírus é adicionado para formar um sanduíche: anticorpo-vírus-anticorpo. Este segundo anticorpo será marcado de alguma maneira para revelar a reação.
Se a reação for positiva, isso mostra que havia proteínas virais, ou seja, que a pessoa estava infectada.
Esse tipo de teste baseado na detecção de moléculas é muito comum no diagnóstico clínico. Sua fundação é a mesma que testes de drogas tradicionais ou testes de gravidez. No caso em questão, demorou a aparecer em cena porque é necessário o uso de anticorpos de captura específicos contra esse vírus específico. A vantagem é que eles são muito mais rápidos e, dependendo do tipo de suporte, podem ser feitos em alguns minutos. Eles podem não precisar de equipamentos específicos ou de pessoal técnico altamente qualificado. Eles são mais baratos. A desvantagem é que eles são muito menos específicos e sensíveis que o RT-PCR.
Um comentário adicional a ambos os testes para detecção direta do genoma ou das proteínas do vírus: que a reação é positiva não implica que o vírus seja ativo e infeccioso. Ou seja, podemos detectar seu genoma ou suas proteínas, mas o vírus não está completo, ou seja, podemos detectar “restos” do vírus.
Detectar anticorpos contra o vírus: Testes Sorológicos
A terceira abordagem é detectar a resposta imune contra o vírus, os anticorpos. É uma detecção indireta, não detectamos o vírus, mas mostramos a resposta imune contra ele. Nesse caso, a amostra que vamos usar é uma gota de sangue, porque vamos detectar os anticorpos que você gerou contra o vírus.
Novamente, existem diferentes técnicas ou suportes para realizar esse tipo de teste, mas mais ou menos todos têm a mesma base. Nesse caso, as proteínas virais são fixadas no suporte, geralmente as proteínas mais expostas ao exterior, como a proteína S do envelope. Isso ocorre porque a primeira coisa que nosso sistema imunológico reconhece é o que está mais distante do vírus. Como neste teste queremos detectar os anticorpos que produzimos, a amostra será uma simples gota de sangue. Se houver anticorpos contra o vírus na amostra, eles grudam e se ligam às proteínas do vírus. Em seguida, é adicionado um segundo anticorpo ao anticorpo humano: geralmente são anticorpos de outro animal que reagem contra nossos próprios anticorpos, porque os anticorpos humanos realmente agem como antígenos em outros animais. Assim, um trio é formado: vírus proteínas-anticorpo humano-anticorpo de outro animal. Este segundo anticorpo será marcado de alguma maneira para revelar a reação.
Se a reação for positiva, isso mostra que havia anticorpos contra o vírus, ou seja, que a pessoa já esteve em algum momento com o vírus e seu sistema imunológico reagiu produzindo anticorpos. Isso não implica necessariamente que você está infectado, talvez tenha sido curado ou simplesmente tenha estado em contato com o vírus e não tenha tido sintomas.
Esse tipo de teste também foi desenvolvido após os testes de RT-PCR, quando já possuíamos soro de pacientes que passaram pela doença. Eles também têm a vantagem de serem muito mais rápidos que a PCR e, dependendo do tipo de suporte, podem ser realizados em apenas alguns minutos. Eles não precisam de equipamentos específicos ou de pessoal técnico altamente qualificado. Eles são mais baratos. A desvantagem é que eles são muito menos específicos que o RT-PCR. Outra desvantagem importante desse tipo de teste é que o organismo leva vários dias para produzir anticorpos detectáveis. Em outras palavras, uma pessoa pode estar infectada, mas durante os primeiros dias não fornece um resultado positivo nesse tipo de teste.
Alguns testes de anticorpos podem distinguir o tipo de imunoglobulina: se é IgM, indicativa de uma infecção recente, ou IgG, indicativa de uma resposta secundária e, portanto, mais prolongada.
Sensibilidade e especificidade
Quando queremos estudar o desempenho ou a eficácia de um teste de diagnóstico, o que fazemos é comparar o resultado desse teste em um grupo de controle de indivíduos que sabemos com certeza que estão saudáveis ou infectados. Normalmente, isso é feito comparando nosso teste com outro que é considerado o “padrão-ouro”. Com esses resultados, a tabela que mostra a distribuição de saudáveis e doentes e o resultado do teste é construída.
Assim, podemos classificar os pacientes como verdadeiros positivos, verdadeiros negativos, falsos positivos (eles não estão infectados, mas o teste é positivo) e falsos negativos (eles estão infectados, mas o teste é negativo). Com esses dados, poderemos calcular a sensibilidade e a especificidade do nosso teste.
A sensibilidade do teste representa a probabilidade de classificar corretamente os infectados, ou seja, a proporção de verdadeiros positivos. É uma proporção na qual o número total de pessoas infectadas está localizado no denominador e os verdadeiros positivos estão no numerador:
Sensibilidade = positivos verdadeiros / total de infectados
Já a especificidade de um teste representa a probabilidade de classificar corretamente os saudáveis, ou seja, a proporção de verdadeiros negativos. É uma proporção em que no denominador aparece o total de pessoas saudáveis e no numerador os verdadeiros negativos:
Especificidade = negativos verdadeiros / total de saudáveis
Para entender melhor, vamos dar um exemplo. Suponha que tenhamos uma população de 100 indivíduos e desejemos avaliar a utilidade da RT-PCR para diagnosticar a doença por coronavírus. Nesse caso, selecionamos a história clínica (analítica, radiológica etc.) como padrão de referência (supondo que esses dados nunca deixem de classificar corretamente os saudáveis e infectados para COVID-19) e realizamos RT-PCR em 100 indivíduos. Dados clínicos indicam que 30 dos 100 têm doença de COVID-19: há 70 saudáveis e 30 doentes.
Ao realizar o RT-PCR nos 100 indivíduos, pudemos obter os seguintes resultados (insisto que é um exemplo fictício):
Consequentemente, a sensibilidade do nosso teste de RT-PCR é de 93% (28/30) e a especificidade de 96% (67/70).
Um dos problemas com esses parâmetros é que a sensibilidade nos diz a probabilidade de classificar corretamente o paciente quando sabemos que ele está doente. Por outro lado, a especificidade nos diz a probabilidade de classificar corretamente os saudáveis, uma vez que sabemos que ele é saudável. Mas isso na prática, muitas vezes, não sabemos. Quando um teste de diagnóstico tem sensibilidade e especificidade perto de 100%, ele se comporta como um teste de referência e, portanto, seus resultados quase sempre serão válidos. No entanto, essa circunstância é excepcional, muito raramente é um teste 100% sensível e específico. Portanto, vários testes de diagnóstico são geralmente usados ao mesmo tempo, porque nos fornecerão mais informações sobre a situação real.
Uma pergunta que podemos fazer é: por que os testes às vezes dão resultados falsos? As causas são múltiplas. Os falsos negativos podem ser devidos à liberação intermitente do vírus, o genoma do vírus não ter sido extraído corretamente, sendo a amostra obtida durante o período de janela em que os anticorpos ainda não foram produzidos, falha dos reagentes de teste, … Os falsos positivos podem ser causados por contaminação no processamento das amostras, reação cruzada com outros vírus, …
Que informações a combinação de RT-PCR e detecção de anticorpos nos fornece?
O teste RT-PCR indica a presença do vírus que está infectado no momento. Os testes de detecção de anticorpos nos dizem quem foi infectado e pode ter sido imunizado, pelo menos por um tempo, contra o coronavírus. De acordo com isso, e com todas as reservas de acordo com a sensibilidade e especificidade de cada teste, se combinarmos os resultados de RT-PCR, com detecção de anticorpos (IgM e IgG), podemos considerar o seguinte:
No entanto, essa abordagem é uma simplificação e tem suas limitações. A falha na detecção de anticorpos pode não significar que você não está imunizado. No caso de infecções por vírus, imunidade celular intracelular não mediada por anticorpos é tão importante ou mais importante quanto a mediada por anticorpos. Ou seja, às vezes não há anticorpos, mas o indivíduo pode ser “imunizado”.
Apesar disso, tudo isso pode nos ajudar a controlar e monitorar a epidemia nas próximas semanas, saber quantas pessoas entraram em contato com o vírus e são imunizadas, definir com mais precisão as taxas de mortalidade do vírus, prever o que será capaz de acontecer se houver um segundo “surto” do vírus e decidir as medidas e a velocidade das decisões que desejamos.
NOTA: Outro anticorpo que tem papel predominante nas secreções mucosas, como as secreções respiratórias, é a IgA. Nesse sentido, já existem testes para detectar IgA que parecem ter uma sensibilidade mais alta que os testes para IgM ou IgG.
Texto gentilmente cedido pelo Dr. Ignacio López-Goñi (@microbioblog)
Catedrático de Microbiología, Departamento de Microbiología y Parasitología, Director del Museo de Ciencias, Universidad de Navarra.
A Centerlab comercializa diversos testes para o coronavírus como:
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Texto original:: https://microbioun.blogspot.com/2020/04/test-diagnostico-coronavirus.html
